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Acides Nucléiques Modifiés

Le thème

Notre recherche repose sur la synthèse de nucléotides contraints et/ou fonctionnalisés afin d’une part, de moduler la conformation des acides nucléiques et d’autre part, de leur apporter des propriétés catalytiques ou de reconnaissance fluorogénique en les associant avec des streptocyanines.

Les axes et résultats marquants


  • Modulation structurale des acides nucléiques
 
L’introduction d’un cycle dioxaphosphorinane à diverses positions sur le squelette sucre-phosphate conduit à des dinucléotides (D-CNA: Dioxaphosphorinane-Constrained Nucleic acid) pré-structurés en restreignant les angles de torsion α à ζ.
Pour les α, β-D-CNA, un pont éthylène relie l’oxygène porté par le phosphate P et la position C5’ du nucléotide inférieur dans les configurations 5’C "R" et P "R" bloquant les angles α et β dans les valeurs canoniques de la double hélice d’ADN B (Fig. 1).
Toute autre combinaison de configuration portée par le 5’C et le P impose une géométrie retrouvée dans les structures non canoniques adoptées par les acides nucléiques. Fig 1. Structure RX d’un dinucléotide TT d’un ADN B (PDB  436D) (droite) et la structure modélisée d’un α, β-D-CNA (gauche)
 
Des familles variées de dinucléotides (Fig. 2) ont été obtenues par synthèse divergente pour les dérivés oxa, thio et seleno D-CNA et en utilisant une réaction intramoléculaire d’Arbuzov pour les dérivés phostone.

Fig 2. Exemple de CNA synthétisés
  
Les études structurales réalisées montrent qu’un large espace conformationel est ainsi exploré (Fig. 3).

Fig 3. Superposition de D-CNA
 
Les phosphoramidites D-CNA correspondants ont été incorporés par synthèse supportée au sein de séquences d’oligonucléotides (ODN) afin d’évaluer :

- l’effet de l’incorporation d’un D-CNA qui présente soit un angle α gauche(-) canonique stabilisant les duplex de type B, soit un angle α gauche(+) stabilisant des structures secondaires non appariées,

- le potentiel des D-CNA à éteindre l’expression de la protéine Huntingtine en fonction de l’allèle lors d’une stratégie antisens ciblant la maladie de Huntington,

- la capacité des D-CNA à stabiliser des structures transitoires consécutives à la déformation de l’ADN au contact de protéines, en particulier, leur influence au sein d’une jonction 4 voies de type ‘Holliday’ produite par le complexe intégron/intégrase lors de l’étape clé de la recombinaison bactérienne.
 
  • Fonctionnalisation des acides nucléiques

Suivant les applications envisagées (mimes nucléiques de protéases ou détecteurs fluorogéniques), des phosphoramidites convertibles (CvNs) portant des liens différents ont été synthétisés à partir de la thymidine 5’-aldéhyde (Schéma 1). Après leur incorporation efficace à des positions précises au sein d’ODN, une réaction de type chimie « click » ou de substitution nucléophile permet ensuite d’introduire les fonctions d’intérêt (Schéma 2).
Schéma 1. Phosphoramidites convertibles et fonctionnalisés

De plus, l’obtention de phosphoramidites déjà fonctionnalisés (FuNs) portant des groupements protégés compatibles avec la synthèse supportée est également nécessaire afin d’introduire plusieurs modifications par brin. Une approche combinatoire à partir de la stratégie convertible et/ou fonctionnalisée permet l’accès à différentes librairies d’ODN fonctionnalisés (FuONs) (Schéma 2).
 
Schéma 2. Obtention de librairies de FuONs
 
  • Fonctionnalisation et structuration des acides nucléiques

1. Vers des mimes de protéases à sérine ?
 
Un brin d’ADN peut alors être doté de capacités catalytiques en introduisant des fonctions hydroxyle/imidazole/acide carboxylique, inspirées de la triade catalytique des protéases à serine (type trypsine) impliquant trois acides aminés coopératifs sérine/histidine/aspartate. Un mime du site catalytique de l’enzyme peut être réalisé en transposant via des études de modélisation moléculaire, la topologie des acides aminés au sein d’une structure secondaire adaptée d’acides nucléiques (jonction 3 voies, bulge ou tige-boucle) permettant ainsi un positionnement programmable et stable de ces fonctions (Schéma 2). Une approche combinatoire donne ainsi accès à une banque de catalyseurs ADN de type DNAzymes dont les capacités d’hydrolyse de la liaison amide seront évaluées.
Alors que la majorité des catalyseurs ADN développés en chimie biomimétique ont une architecture reposant sur la double hélice iconique, nous nous sommes, au contraire, appuyés sur une jonction 3 voies (3WJ) fonctionnalisée en son cœur pour structurer un site actif nucléique. Des phosphoramidites convertibles de type alcyne ont été incorporés par SPS puis une étape de conjugaison de type CuAAC a permis d’introduire les groupements rappelant la chaîne latérale des acides aminés impliqués afin de recréer à façon un site actif à l’agencement contrôlé (Schéma 3).

Schéma 3. Synthèse par chimie CuAAC de 5'-FuONs et structuration en jonction 3 voies

2. Détection fluorogénique par marquage d’ODN par des streptocyanines
 
Une méthode de détection fluorogénique de structures secondaires d’ADN ou de petites molécules via le greffage covalent de précurseurs de streptocyanines est envisagée. Après l’incorporation d’un phosphoramidite convertible de type bromopentényle, le groupement amino résultant de l’aminolyse lors de l’étape finale de déprotection du CvON peut réagir avec un sel d’hémicarboxonium non fluorescent pour conduire à un FuON fluorescent.
 
Schéma 4. Détection fluorogénique
 
 
 

Date de mise à jour 14 janvier 2019


Collaborations

  • Complexe intégron/integrase : Dr Gopaul, Institut Pasteur (Paris)
  • Modélisation : Dr Tarrat, CEMES (Toulouse)
  • Aptamères : Dr Vincent Ecochard, IPBS (Toulouse)
  • Détecteurs bio-puces : Dr Laurence Salomé, IPBS (Toulouse)

Publications principales

  • Gerland, B., Addamiano, C., Renard, B.-L., Payrastre, C., Gopaul, D., and Escudier, J.-M. Thio- and Seleno-Dioxaphosphorinane-Constrained Dinucleotides (D-CNA): Synthesis and Conformational Study, (2017), Eur. J. Org. Chem. 1450-1464. Voir

  • Addamiano, C., Gerland, B., Payrastre, C., and Escudier, J. M. DNA Three Way Junction Core Decorated with Amino Acids-Like Residues-Synthesis and Characterization, (2016), Molecules 21, 1082. Voir

  • Gerland, B., Millard, P., Dupouy, C., Renard, B.-L., and Escudier, J.-M. Stabilization of hairpins and bulged secondary structures of nucleic acids by single incorporation of α,β-D-CNA featuring a gauche(+) alpha torsional angle, (2014), RSC Advances 4, 48821-48826. Voir

  • Østergaard, M. E., Gerland, B., Escudier, J.-M., Swayze, E. E., and Seth, P. P. Differential Effects on Allele Selective Silencing of Mutant Huntingtin by Two Stereoisomers of α,β-Constrained Nucleic Acid, (2014), ACS Chemical Biology 9, 1975-1979. Voir

  • Maether, M.-P., Lapin, K., Muntean, A., Payrastre, C., and Escudier, J.-M. Oligonucleotide Labelling Using a Fluorogenic “Click” Reaction with a Hemicarboxonium Salt, (2013), Molecules 18, 12966-12976. Voir

  • Catana, D.-A., Renard, B.-L., Maturano, M., Payrastre, C., Tarrat, N., and Escudier, J.-M. Dioxaphosphorinane-constrained nucleic acid dinucleotides as tools for structural tuning of nucleic acids, (2012), Journal of Nucleic Acids, 215876. Voir

Financement

  • ANR Blanc Modulation of Integrase Activity by Means of Conformationaly Constrained Nucleotides (MIAM CoCoNuts). (2011).
  • ANR JCJC Protease-like oligonucleotides, functionalization and catalysis (PrOLIFiC). (2018).
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