Thème

Notre recherche repose sur la synthèse de nucléotides contraints et/ou fonctionnalisés afin d’une part, de moduler la conformation des acides nucléiques et d’autre part, de leur apporter des propriétés catalytiques ou de reconnaissance fluorogénique en les associant avec des streptocyanines.

Modulation structurale des acides nucléiques

L’introduction d’un cycle dioxaphosphorinane à diverses positions sur le squelette sucre-phosphate conduit à des dinucléotides (D-CNA: Dioxaphosphorinane-Constrained Nucleic Acid) pré-structurés en restreignant les angles de torsion α à z.

Pour les α, β-D-CNA, un pont éthylène relie l’oxygène porté par le phosphate P et la position C5’ du nucléotide inférieur dans les configurations 5’C "R" et P "R" bloquant les angles α et β dans les valeurs canoniques de la double hélice d’ADN B (Fig. 1). Toute autre combinaison de configuration portée par le 5’C et le P impose une géométrie retrouvée dans les structures non canoniques adoptées par les acides nucléiques.

Des familles variées de dinucléotides (Fig. 2) ont été obtenues par synthèse divergente pour les dérivés oxa, thio et seleno D-CNA et en utilisant une réaction intramoléculaire d’Arbuzov pour les dérivés phostone. Les études structurales réalisées montrent qu’un large espace conformationnel est ainsi exploré (Fig. 3).

 

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Fig 1. Structure RX d’un dinucléotide TT d’un ADN B (PDB 436D) (gauche) et la structure modélisée d’un α, β-D-CNA (droite)


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Fig 2. Exemple de CNA synthétisés

 

Fig 3. Superposition de D-CNA

Les phosphoramidites D-CNA correspondants ont été incorporés par synthèse supportée (SPS) au sein de séquences d’oligonucléotides (ODN) afin d’évaluer :

  • l’effet de l’incorporation d’un D-CNA qui présente soit un angle α gauche(-) canonique stabilisant les duplex de type B, soit un angle α gauche(+) stabilisant des structures secondaires non appariées,

  • le potentiel des D-CNA à éteindre l’expression de la protéine Huntingtine en fonction de l’allèle lors d’une stratégie antisens ciblant la maladie de Huntington,

  • la capacité des D-CNA à stabiliser des structures transitoires consécutives à la déformation de l’ADN au contact de protéines, en particulier, leur influence au sein d’une jonction 4 voies de type ‘Holliday’ produite par le complexe intégron/intégrase lors de l’étape clé de la recombinaison bactérienne.

Fonctionnalisation des acides nucléiques

Suivant les applications envisagées (mimes nucléiques de protéases ou détecteurs fluorogéniques), des phosphoramidites convertibles (CvNs) portant des liens différents ont été synthétisés à partir de la thymidine 5’-aldéhyde (Schéma 1). Après leur incorporation efficace à des positions précises au sein d’ODN, une réaction de type chimie « click » ou de substitution nucléophile permet ensuite d’introduire les fonctions d’intérêt (Schéma 2). De plus, l’obtention de phosphoramidites déjà fonctionnalisés (FuNs) portant des groupements protégés compatibles avec la synthèse supportée est également nécessaire afin d’introduire plusieurs modifications par brin. Une approche combinatoire à partir de la stratégie convertible et/ou fonctionnalisée permet l’accès à différentes librairies d’ODN fonctionnalisés (FuONs) (Schéma 2).

nullSchéma 1 Phosphoramidites convertibles et fonctionnalisés

null Schéma 2 Obtention de librairies de FuONs

            1- Vers des mimes de protéases à sérine ?

(Financé par ANR JCJC PrOLIFiC, début 01/2019)

Un brin d’ADN peut alors être doté de capacités catalytiques en introduisant des fonctions hydroxyle/imidazole/acide carboxylique, inspirées de la triade catalytique des protéases à serine (type trypsine) impliquant trois acides aminés coopératifs sérine/histidine/aspartate. Un mime du site catalytique de l’enzyme peut être réalisé en transposant via des études de modélisation moléculaire, la topologie des acides aminés au sein d’une structure secondaire adaptée d’acides nucléiques (jonction 3 voies, bulge ou tige-boucle) permettant ainsi un positionnement programmable et stable de ces fonctions (Schéma 3). Une approche combinatoire donne ainsi accès à une banque de catalyseurs ADN de type DNAzymes dont les capacités d’hydrolyse de la liaison amide seront évaluées.

Alors que la majorité des catalyseurs ADN développés en chimie biomimétique ont une architecture reposant sur la double hélice iconique, nous nous sommes, au contraire, appuyés sur une jonction 3 voies (3WJ) fonctionnalisée en son cœur pour structurer un site actif nucléique. Des phosphoramidites convertibles de type alcyne ont été incorporés par SPS puis une étape de conjugaison de type CuAAC a permis d’introduire les groupements rappelant la chaîne latérale des acides aminés impliqués afin de recréer à façon un site actif à l’agencement contrôlé (Schéma 3).

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Schéma 3. Synthèse par chimie CuAAC de 5'-FuONs et structuration en jonction 3 voies

 

            2- Détection fluorogénique par marquage d’ODN par des streptocyanines

In order to detect DNA secondary structures or small organic molecules, a method using streptocyanine-labelled ODN was developed, starting from non fluorescent hemicarboxonium salts and aminoalkyl-functionnalized ODN. Following the incorporation of a convertible 5'-bromopentenyle phosphoramidite, the resulting amino alkyl function formed after the final aminolysis attacks through a nucleophile substitution, a hemicarboxonium salt to give fluorescent ODN, further analyzed for their spectrophotometric properties (Scheme 4).

nullScheme 4. Fluorogenic detection

Fonctionnalisation et structuration des acides nucléiques

La convergence des deux sous-thèmes est rendue possible par le développement d’une nouvelle famille de nucléotides convertibles et contraints (Convertible & Constraint Nucleic Acid ; C2NA) (Fig 4). La mise au point de la synthèse de cycle oxaza-phosphorinane permet d’introduire la contrainte sur les angles de torsion du squelette sucre/phosphate et par alkylation de l’atome d’azote du cycle d’ajouter la fonctionnalisation via la chimie « click » de type CuAAC. L'introduction de ce bras propargyle ne modifie pas notablement les valeurs d'angles de torsion en comparaison de celles obtenues pour leurs analogues en série CNA. De plus, l'introduction d'un marqueur fluorescent par chimie Click au sein de structures secondaires de type tige boucle permet de valider l'approche. Cet exemple met en évidence l'importance de ces synthons lorsque structuration et fonctionnalisation seront nécessaires sur une même position.

nullFig 4. Gauche : α,β -C2NA nucléotides, droite : superposition de structures minimisées